一株嗜酸乳杆菌的分离与鉴定(2)
DNA模版 2 μL,补足重蒸水至终体积25 μL。
PCR反应条件:95 ℃ 3 min预变性,94 ℃ 45 s变性,33 ℃ 30 s退火,72 ℃ 1 min延伸,30个循环,72 ℃ 10 min延伸。引物序列上游引物F:5′-T ̄T ̄G ̄A ̄T ̄C ̄T ̄G ̄G ̄A ̄T ̄T ̄A ̄C ̄C ̄G ̄C ̄G ̄G ̄C-3′,下游引物R:5′-A ̄G ̄G ̄G ̄T ̄A ̄T ̄C ̄T ̄A ̄A ̄T ̄A ̄C ̄T ̄C ̄C ̄T ̄A ̄C-3′。
2 结果与讨论
2.1 菌株的分离纯化
用LBS 培养基从淘米水发酵液中共分离纯化得到5株具有乳酸菌典型特点的菌株,其中3株菌株为革兰氏阳性菌,可作为嗜酸乳杆菌疑似菌株,编号为1-3,3株乳杆菌疑似菌株菌落形态见表1,菌株放大1000倍后显微形态见图1。
表1 菌株菌落形态及革兰氏染色结果Table 1 Characteristics of colony morphology and gram stain编号菌落形态革兰氏染色结果1菌落乳白色,凸起,光滑,边缘整齐阳性2菌落乳白色,凸起,粗糙,边缘不规则阳性3菌落乳白色,凸起,光滑,边缘整齐阳性
图1菌株显微形态(1 000倍放大) morphology of three bacterial strains(×1 000)
2.2 菌株生理生化鉴定
通过对3株嗜酸乳杆菌疑似菌株进行46项生理生化试验,结果见表2。
由表2可初步确定3号菌株与嗜酸乳杆菌的生理生化指标相近,其鉴定可信度达到90%。
表2 3号菌株46种生理生化鉴定结果Table 2 46 physiological and biochemical indexes of No. 3序号生物化学鉴定仪器结果预期结果1精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素-±2甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++3L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++4L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+±5L-组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素--6L-异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+-7L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++8L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++9L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+-10L-焦谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素+-11L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++12甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素++133-甲基戊二酸--14粘杆菌素+±15D-果糖++16D-葡萄糖酸+-17D-甘露醇++18亚氨基二乙酸--19α-酮戊二酸--203-甲基己二酸+±21多粘菌素B+±22胸腺嘧啶脱氧核苷-±234甲基伞形酮-AD-葡萄糖苷-±244甲基伞形酮-BD-纤维二糖苷-+254甲基伞形酮-BD-半乳糖苷-±264甲基伞形酮-BD-葡萄糖苷酸-±274甲基伞形酮-BD-葡萄糖苷++284甲基伞形酮-N-乙酰-BD-葡萄糖胺+±294甲基伞形酮-磷酸--304甲基伞形酮-磷酸(带海藻糖)+±31丙氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺--32L-脯氨酸-对硝基苯胺--33缬氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺-±344-甲基伞形酮-AD-葡萄糖苷酸--35对硝基苯-磷酸--36β-龙胆二糖-±37右旋糖+±38D-蔗糖-±39D-塔格糖--40D-海藻糖+±41麦芽糖+±42α-D葡萄糖甲苷-±43麦芽三糖+±44N-乙酰-葡萄糖胺+±45尿素--46七叶苷++
2.3 菌株分子生物学鉴定
细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列[12-13]。在 16S rRNA 分子中,可变区序列因细菌不同而异,恒定区序列基本保守,所以可利用恒定区序列设计引物,将16S rDNA片段扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定[14-15]。
将3号菌株进行16S rDNA测序,其序列如下。
5′-T ̄G ̄C ̄T ̄G ̄G ̄C ̄A ̄C ̄G ̄T ̄A ̄G ̄T ̄T ̄A ̄G ̄C ̄C ̄G ̄T ̄G ̄A ̄C ̄T ̄T ̄T ̄C ̄T ̄G ̄G ̄T ̄T ̄G ̄A ̄T ̄T ̄A ̄C ̄C ̄G ̄T ̄C ̄A ̄A ̄A ̄T ̄A ̄A ̄A ̄G ̄G ̄C ̄C ̄A ̄G ̄T ̄T ̄A ̄C ̄T ̄A ̄C ̄C ̄T ̄C ̄T ̄A ̄T ̄C ̄C ̄T ̄T ̄C ̄T ̄T ̄C ̄A ̄C ̄C ̄G ̄A ̄C ̄A ̄A ̄C ̄A ̄G ̄A ̄G ̄C ̄T ̄T ̄T ̄A ̄C ̄G ̄A ̄T ̄C ̄C ̄G ̄A ̄A ̄A ̄A ̄C ̄C ̄T ̄T ̄C ̄T ̄T ̄C ̄A ̄C ̄T ̄C ̄A ̄C ̄G ̄C ̄G ̄G ̄C ̄G ̄T ̄T ̄G ̄C ̄T ̄C ̄C ̄A ̄T ̄C ̄A ̄G ̄A ̄C ̄T ̄T ̄G ̄C ̄G ̄T ̄C ̄C ̄A ̄T ̄T ̄G ̄T ̄G ̄G ̄A ̄A ̄G ̄A ̄T ̄T ̄C ̄C ̄C ̄T ̄A ̄C ̄T ̄G ̄C ̄T ̄G ̄C ̄C ̄T ̄C ̄C ̄C-3′。
将测序结果用 BLAST进行序列比对,结果表明该菌株与GenBank中发表的嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)同源性为 99%。可见3号菌株与嗜酸乳杆菌同源性较强,鉴定该菌株为嗜酸乳杆菌,命名为CFC-001。
嗜酸乳杆菌具有多种益生功效,包括调节肠道菌群失调,通过杀菌和竞争附着位点的作用抑制病原菌的滋生和入侵,调节免疫力,延缓机体衰老等作用[16]。
目前桂林市黄洛瑶寨地区人群在洗发过程中长期使用淘米水发酵液,不使用任何洗发水和护发素,该地区发质和头发根部头皮质量都要优于其他地区。经过本实验筛选后发现该淘米水发酵液中嗜酸乳杆菌的菌落总数达到3.8×107CFU/mL,是该体系中的优势菌群之一,所以认为嗜酸乳杆菌可以对头发和头皮的微生态产生积极的影响,可以有效养护头发与头皮,但是作用机制尚不明确,需进行进一步的研究。
文章来源:《中国微生态学杂志》 网址: http://www.zgwstxzz.cn/qikandaodu/2021/0104/350.html