中国白酒酿造微生态学研究技术进展及应用状况(2)
4 近年白酒微生态学研究技术的发展及应用
近年来分子生物学相关技术的快速发展有力地促进了白酒微生态学和研究技术的发展。目前白酒微生态学研究中除传统的微生物分析方法外,还用到一些生态学研究常用技术,例如磷脂脂肪酸分析方法(PLFA),而用到的最主要的技术为分子生物学技术,如基于PCR 的指纹图谱分析、基因测序及系统发育分析、克隆文库、荧光原位杂交技术(FISH)、宏基因组学、蛋白组学、代谢组学等。
4.1 基于PCR 的指纹图谱分析技术
现在白酒酿造微生态研究中最常用的技术就是基于PCR 的指纹图谱分析技术,主要有DGGE(变性梯度凝胶电泳,Denaturing gradient gel electrophoresis)、SSCP(单链构象多态性,Single strand conformation polymorphism)、RFLP(限制性片段长度多态性,Restriction fragment length polymorphism)等。在这些技术中使用最多的是PCR-DGGE 技术,此外DGGE 分析技术还可以与实时定量PCR(quantitative real-time PCR)、DNA 芯片、巢式PCR(Nested PCR)等技术相结合分析白酒酿造微生物的多样性。
PCR-DGGE 技术[6-7]首先分离纯化环境样品DNA,再用通用引物PCR 扩增核糖体核糖核酸的部分序列,原核生物一般是16S rRNA/16S rDNA 的V3、V4、V5 区,真核生物18S rRNA/18S rDNA 的V4 区以及ITS 序列,然后进行DGGE 分析。再通过DGGE 优势条带的切胶回收、测序、鉴定,获取微生物种群结构信息。
在白酒酿造微生态的研究中,以PCR-DGGE技术为主并结合其他技术在窖泥、糟醅、大曲的微生物多样性研究中均有广泛应用。Liang 等[8]为了区分成熟窖泥和退化窖泥,用PCR-DGGE 和qPCR技术比较分析不同地区中国浓香型白酒成熟窖泥与退化窖泥中细菌群落。此作者还用同样的技术分析了新窖泥和成熟窖泥的细菌群落结构[9]。Liu等[10]用DGGE 技术分析了中国浓香型白酒窖泥(窖龄分别为1 年、50 年、100 年、400 年)中梭菌I 的多样性。Deng 等[11]用PCR-DGGE 方法分析不同窖龄窖泥微生物群落。Ding 等[12]用PCR-DGGE 与FISH 结合分析人工窖泥中的古细菌和真细菌群落特征。Wang 等[13-14]从不同大曲中提取DNA 用于PCR 扩增,使用16S rRNA,26S rRNA 和18S rRNA的通用引物,扩增后分别用DGGE 方法分析,研究了清香型大曲的微生物多样性。Xiong 等[15]用PCR-DGGE 方法系统研究了3 种大曲(机制大曲、手工、混合制曲)中细菌、芽孢杆菌、真菌、酵母群落。Du 等[16]用PCR 扩增放线菌rDNA,然后用DGGE 方法分析了大曲培养过程中链霉菌的生态情况,结果表明,大曲培养过程中链霉菌广泛存在。
之所以基于PCR 的DGGE 应用这么广泛,是因为其有突出优点[17-18]:可以快速、简便通过DGGE 图谱来检测和鉴定微生物种类。但是还有一些技术缺陷,需要进一步改进[17-18],主要缺陷有:①检出信息量低,难以建立系统发育树;② 很难检出微生物总量低的微生物(<1%);③有共迁移现象,而且影响结果的因素比较多,例如DNA 提取分离效果、凝胶浓度、PCR 扩增效率、电泳时间等。
针对PCR-DGGE 的一些弱点,也有改进的方法,例如NestedPCR-DGGE[17],通过特殊引物的两次扩增,既增加了检测的灵敏性,又增加了检测的可靠性。Wang 等[19]从3 个发酵糟醅和12 个环境因子中提取总DNA,包括糟醅、大曲、窖泥、土壤、空气、高粱,然后扩增16S 和18S rRNA 基因,用Nested PCR-DGGE 分析典型微生物的分布。同时用16S rRNA 和内转录间隔区(ITS)的qPCR 扩增评估样品中微生物丰度。Ding 等[20]用NestedPCR-DGGE 方法调查和比较了浓香型白酒窖池窖壁和窖底窖泥中古细菌和真菌群落结构。Zhang 等[21]用NestedPCR-DGGE 分析大曲微生物群落特征。
除了使用PCR-DGGE 技术,还有一些研究者利用基于PCR 指纹图谱分析的其他技术,例如Chen 等[22]优化了PCR-SSCP 分析条件,然后用于浓香型白酒发酵微生物多样性分析。Hai 等[23]利用PCR-SSCP研究河套酒大曲细菌群落特征。Liu等[24]用实时定量PCR 研究了中国浓香型白酒窖泥中Syntrophomonadaceae 类菌的发展现状,研究结果表明,此方法快速、灵活、准确,针对性强、灵敏度高。定量结果可以进一步了解Syntrophomonadaceae 在窖泥中不同时间和空间的分布。Wei 等[25]用荧光实时PCR 定量不同窖龄窖泥(3 年、13 年、25年)中的微生物的数量。
4.2 基因测序分析及克隆文库技术
DNA 序列分析方法是利用已有的许多功能基因及专门的rDNA 序列数据库软件,进行序列比较,揭示更高水平的多态性。大多数DNA 多样性的研究以核糖体RNA(rRNA)或其编码基因rDNA为对象,利用其中的16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息的保守区和变异区,区分微生物种差异[1,26,27]。
文章来源:《中国微生态学杂志》 网址: http://www.zgwstxzz.cn/qikandaodu/2021/0104/348.html