中国白酒酿造微生态学研究技术进展及应用状况(3)
在白酒的微生态研究中也主要是利用16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息进行微生物多样性研究。例如王涛等[28]基于16S rRNA 的基因序列分析研究了宜宾地区浓香型大曲酒酿造过程中可培养细菌系统发育多样性。Zhang 等[29]用DGGE 方法和18S rRNA 基因分析方法研究分析了中国浓香型白酒酿造过程中糟醅的真菌群落。Chen 等[22]用PCR 扩增的片段为16S rDNA 的V3 区研究发酵糟醅的微生物群落。Liang 等[30]用基于16S rRNA 基因的V3 区鉴定大曲中细菌。Zheng等[31]分析16S rDNA 的V9 区,研究大曲制曲过程中芽孢杆菌群落。Deng 等[11]分析16S rDNA 的v6 到V8 区,研究不同时期浓香型酒窖池窖泥的微生物群落。除了以上对16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列分析研究,还有专家学者利用其他的一些基因序列进行微生物多样性的研究。Sun 等[32]分析26S rDNA D1/D2 分区的序列,对茅台酒不同酿造阶段的酵母进行鉴定。Xiang 等[33-34]基于SSU rRNA 免培养技术,研究了中国浓香型酒酿造过程中发酵糟微生物群落的演替。
克隆文库技术是以PCR 技术为基础,并与基因测序技术相结合,经常用于环境微生态的研究。其基本过程[35-37]是先提取样本DNA,然后用通用引物进行PCR 扩增,回收纯化扩增产物、构建克隆文库、测序分析、构建系统发育树,最后推测复杂环境微生物群落的分类学地位。此技术在白酒微生态研究中也有较多使用。例如陈玲等[35]用16S rDNA 克隆文库法和高通量测序法,分析了浓香型白酒大曲中细菌微生物群落的组成,并通过丰度和多样性分析,比较了两种方法在研究大曲样品细菌多样性方面的适用性。Zheng 等[38]利用16S rRNA 和26S rRNA 基因克隆文库分析不同大曲中微生物群落特征。王涛等[39]利用16S rRNA 基因克隆文库,分析了浓香型白酒窖泥、出窖糟醅的细菌区系的相似性。王明跃等[40]用PCR-ARDRA和16S rRNA 基因克隆测序技术,对四川和安徽产区窖泥细菌和古菌进行了研究。克隆文库技术,技术成熟,可操作性好。但其操作步骤较为繁琐,工作量较大,反映总体微生物信息有限,并有可能在一定程度上高估物种丰度及低估微生物群落大小和多样性。但如果主要以优势菌群的认识研究为主,不看重极低丰度菌群的存在,不失为一种很好的酿造微生态学研究方法。
4.3 磷脂脂肪酸分析方法(PLFA)及荧光原位杂交技术(FISH)
磷脂脂肪酸分析方法[41-42]是基于细胞中磷脂类化合物相对稳定作为微生物生物量指标,磷脂类化合物中脂肪酸组成特异性和多态性能反映环境中微生物群落结构的多样性。此方法能够依靠脂肪酸谱图定量描述整个微生物群落,是一种快捷、可靠的检测方法,但它不能在菌种和菌株的水平鉴别出微生物的种类。此外,微生物在不同的生长时期以及环境压力下的磷脂脂肪酸的含量会有所变化,也会给监测带来困难。
磷脂脂肪酸分析方法是生态学研究中的一种常用方法,近年在白酒微生态研究中也有较多应用。Zhang 等[43]用PLFA 方法分析3 种汾酒大曲的微生物群落,此方法可潜在用于各种曲的代表性生物标记。Zheng 等[44]利用非培养技术(PLFA、DGGE)对两个不同厂(剑南春和丰谷)糟醅的不同糟层(上、中、下层)细菌群落的空间分布进行研究。Wu 等[45]用PLFA 方法分析大曲微生物群落特征。Zhao 等[46]用磷脂脂肪酸分析方法研究了不同窖龄窖池窖泥的菌群落结构。
荧光原位杂交技术[47-48]是dsDNA 变性后和带有互补序列的同源单链褪火配对形成双链DNA 或DNA/RNA 异质双链结构的过程,利用荧光标记的探针探测同源核酸序列。荧光原位杂交技术能够同时对微生物进行定性、定量和其群落结构进行研究,操作容易、安全、检测迅速,己广泛用于研究环境微生态和食品微生态。目前有人也开始用此技术研究白酒微生态,例如吴冬梅等[49]利用荧光原位杂交(FISH)技术,研究了窖泥微生物群落结构特征。Ding 等[12]结合PCR-DGGE 和荧光原位杂交(FISH)技术研究了浓香白酒窖池古生菌和真菌群落结构特征。
5 白酒酿造微生态研究的新技术
分子生物学快速发展,新技术不断涌现,例如新一代测序技术(高通量测序技术)、基因芯片技术、宏基因组学技术、生物信息学技术、代谢组学技术、蛋白质组学技术等。宏基因组学是以新一代测序和基因芯片技术为基础的,已经是比较成熟的组学技术,在环境微生物学研究中已有较广泛应用,在白酒酿造微生态学研究中也开始使用。其他的一些新技术虽然不够成熟,但随着这些技术的不断完善,将来肯定会成为白酒酿造微生态学研究中的重要常用技术。因此进一步了解这些新技术的发展状况,对白酒酿造微生态将来的发展非常重要。
文章来源:《中国微生态学杂志》 网址: http://www.zgwstxzz.cn/qikandaodu/2021/0104/348.html